- Лабораторные методы обнаружения инфекций
- Этапы диагностики методом ПЦР
- Что может ПЦР
- Чего не может ПЦР
- Выводы
Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR), открытая американцем Кэрри Муллисом в 1983 году, и метод детекции ДНК, разработанный на ее основе, принесли ученому Нобелевскую премию по химии 1993 года. Сегодня это один из самых точных методов в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний. Он позволяет обнаружить то, что до появления ПЦР оставалось скрытым.
Почему же такой замечательный метод не вытеснил другие виды лабораторной диагностики, а применяется наравне с ними, и в чем-то даже проигрывает им?
Лабораторные методы обнаружения инфекций
Существуют разные методы обнаружения инфекций в биологических жидкостях пациентов.
- Микроскопические методы.
Лаборант при помощи микроскопа выискивает патогенные микроорганизмы в специально окрашенном мазке — пробе выделений из мочеиспускательного канала или со стенки слизистой. Дешево, просто, но малоинформативно. Таким образом, удается разглядеть трихомонад, гонококков, хламидий, уреаплазму и гарднерелл. И все.
- Культуральные методы (посевы).
Такой же точно мазок наносят на питательную среду в чашке Петри и смотрят, что вырастет. Все микроорганизмы образуют разные колонии — по цвету, форме, размеру и консистенции. Вот по этим колониям и определяется: кто был в мазке. Тоже, в общем, недорого, но долго, выращивание микроорганизмов может длиться от 3 до 8 недель – за это время состояние пациента может значительно ухудшиться. И еще есть один нюанс: вырастет только то, что было в мазке и в определенном количестве. Если патогенных бактерий было слишком мало, то выявить их не удастся.
- Анализы крови.
Любые возбудители оставляют после контакта с организмом человека свои иммунные следы в его крови: антигены или антитела. Метод не самый дешевый, зато быстрый. Но и тут следует учитывать, что до определенного момента инфекция уже может быть в организме, а антитела и антигены пока еще не выявляются: слишком мало времени прошло или слишком низкая концентрация патогенных микроорганизмов. Кроме того, данный метод не позволяет различать виды отдельных микроорганизмов, которые далеко не всегда опасны для человека.
Итак, у всех методов есть свои недостатки. Среди ключевых можно выделить следующие:
- Низкая чувствительность, то есть необходимо определенное минимальное количество микроорганизмов в пробе, чтобы их можно было обнаружить.
- Низкая специфичность, то есть, если у двух разных видов бактерий (один опасный, другой нет) на поверхности клетки есть одинаковые белки, то не все анализы позволяют узнать, какой именно из этих видов имеется в организме.
Обе этих проблемы позволяет решить метод ПЦР.
Этапы диагностики методом ПЦР
В основе метода лежит факт, что каждый живой организм (микро- или макро-) имеет уникальную ДНК (или РНК – если речь идет о некоторых вирусах). Это лучший маркер присутствия чужеродного микроорганизма в теле человека, какой только можно себе представить. Даже если в пробе присутствуют следовые количества ДНК, значит организм тем или иным способом уже сталкивался с данной инфекцией. А как эти следовые количества «увидеть»? Их нужно для начала «приумножить».
Метод ПЦР состоит из следующих этапов.
- 1 этап. Подготовка пробы, то есть выделение ДНК.
Предположим, что мы ищем в пробе определенную бактерию, например, хламидию (Chlamydia trachomatis – возбудитель хламидиоза). На этом этапе мы не знаем, есть ли в пробе ее ДНК. Проба специальным образом обрабатывается, чтобы сконцентрировать ДНК, если она там есть, в минимальном объёме жидкости для ПЦР.
- 2 этап. Амплификация (умножение) ДНК с помощью ПЦР.
Сначала двухцепочечную ДНК «расплетают» путем повышения температуры и получают одноцепочечные нити. После этого в раствор добавляют специальные короткие фрагменты нуклеиновой кислоты — праймеры. Они будут затравкой для синтеза второй цепочки ДНК на одноцепочечной «базе». Итак, база есть, затравка есть, осталось добавить нуклеотиды, из которых будет достраиваться вторая цепочка, и устройство, которое будет заниматься этим строительством. В роли такого устройства выступает фермент ДНК-полимераза, а процесс достраивания одноцепочечной ДНК до двухцепочечной и является полимеразной цепной реакцией.
В начале цикла у нас было две одноцепочечных ДНК, в конце мы получим две двухцепочечных ДНК. И такой цикл повторяется многократно, пока количество ДНК не окажется достаточным для лабораторного анализа. Для умножения ДНК используют специальные аппараты — амплификаторы. На этом этапе исследователи тоже все еще не знают, что за ДНК они амплифицировали и есть ли в пробе ДНК хламидии.
Следует также добавить, что существует множество разновидностей метода ПЦР, которые применяются в зависимости от поставленной перед исследователем задачи.
- 3 этап. Детекция (определение) ДНК.
На данном этапе как раз и происходит выяснение, есть ли ДНК искомой бактерии в пробе. Раньше для этого использовался метод электрофореза, а позднее ученые стали использовать ДНК-зонды – специальные меченые фрагменты ДНК, которые взаимодействуют только со специфическим участком анализируемой ДНК и позволяют таким образом определять конкретные последовательности нуклеотидов. Наконец, для экспресс-диагностики сейчас используют флуоресцентные маркеры, которые позволяют определять результат ПЦР прямо в реакционной пробирке. Если ДНК хламидии в пробе была – лаборант об этом узнает.
А что делать, если геном вируса представляет собой не ДНК, а РНК? Пример: пандемический коронавирус SARS-CoV-2. В этом случае добавляется еще один этап — обратная транскрипция. Из образца слизи, полученного из носоглотки, выделяют РНК, проводят обратную транскрипцию и получают аналог в виде ДНК. И уже эту ДНК амплифицируют и детектируют. Поэтому говорят, что для определения коронавируса используют полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР в реальном времени).
Что может ПЦР
Метод ПЦР позволяет выявлять патогенные микроорганизмы, а также проводить анализ на предмет их резистентности (устойчивости) к лекарствам. В этом отношении, по сравнению с культуральными и другими методами, ПЦР намного быстрее и точнее. Методы ПЦР находят все более широкое применение в медицинской практике. Например, сейчас с его помощью в некоторых случаях можно определить наличие (или отсутствие) генетических маркеров резистентности.
Преимущества ПЦР:
- Чувствительность.
Для обнаружения присутствия патогенного микроорганизма в теле пациента достаточно даже одной копии его ДНК. 1 микроорганизм на пробу – для ПЦР этого достаточно, подобный подход невозможен для других методов диагностики.
- Специфичность.
Как было сказано ранее, уникальность ДНК каждого вида микроорганизмов позволяет обнаружить их даже при наличии больших объёмов чужой, лишней, мешающей проведению анализа, «балластной» ДНК.
- Скорость проведения анализа.
Весь процесс диагностики методом ПЦР занимает не больше 1 рабочего дня.
- Производительность.
ПЦР-диагностика, на сегодняшний день, полностью автоматизированный процесс.
Чего не может ПЦР
Метод ПЦР — это действительно гениальное изобретение молекулярной биологии XX века. Но иногда он настолько хорош, что непригоден для диагностики.
Недостатки ПЦР:
- Специфичность.
Она потрясающе высокая, но слишком узкая. При посеве в чашке Петри вырастет все, что было в пробе. А при проведении ПЦР можно обнаружить только то, что искали, то, для чего использовали ДНК-зонды. Нельзя проводить ПЦР-анализ на хламидии и случайно обнаружить гепатит.
- Чувствительность.
Существует множество микроорганизмов, которых врачи относят к условно-патогенным. Они являются частью нормальной микрофлоры человека, пока их концентрация не превышает определенных пределов. ПЦР конечно покажет их наличие, но это вовсе не значит, что человек болен. К таким микроорганизмам относятся микоплазма, уреаплазма, гарднерелла и др.
- Проблема контаминации.
Контаминация – это загрязнение пробы образцами ДНК извне. Диагностика методом ПЦР должна проводиться в специально подготовленных лабораториях и в стерильных условиях. Даже одна копия «внешней» ДНК из другой пробы, из воздуха лаборатории или с перчаток лаборанта может привести к ложноположительным результатам – при наличии соответствующих праймеров.
- Влияние на ПЦР других компонентов пробы.
Чувствительность ПЦР может значительно снижаться под воздействием других веществ. Например, некоторые препараты (антикоагулянты) подавляют реакцию амплификации. Для выявления таких ситуаций существуют специальные методы контроля. Но риск получения ложноотрицательных результатов все равно остается.
- Стоимость.
Это дорогостоящий метод. Само оборудование и реактивы для него, а также подготовка лаборантов, умеющих с ними обращаться, обходятся клиникам и лабораториям очень дорого. В России подобное оборудование не производится, а применение отечественных реактивов ухудшает качество анализа.
Выводы
- ПЦР – отличный современный и недешевый метод диагностики возбудителей различных инфекционных заболеваний.
- Не всегда для диагностики требуется метод ПЦР. Если врач не считает нужным направлять вас на анализ – доверьтесь его мнению. При самолечении и самостоятельной сдаче анализов для исследования методом ПЦР в сетевой лаборатории высок риск того, что вы будете годами лечиться от несуществующей болезни.
- Если лаборатория выдала вам результат, в котором вы сомневаетесь, пересдайте анализ в другой лаборатории. Риски ложноположительных и ложноотрицательных результатов никто не отменял – несмотря на всю современность и технологичность метода.
