24.04.2016 Обновлено: 02.12.2020 9678

ПЦР: метод, который слишком хорош

Эксперт

Сундуков Александр Вадимович

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR), открытая американцем Кэрри Муллисом в 1983 году, и метод детекции ДНК, разработанный на ее основе, принесли ученому Нобелевскую премию по химии 1993 года. Сегодня это один из самых точных методов в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний. Он позволяет обнаружить то, что до появления ПЦР оставалось скрытым.

Почему же такой замечательный метод не вытеснил другие виды лабораторной диагностики, а применяется наравне с ними, и в чем-то даже проигрывает им?

Лабораторные методы обнаружения инфекций

Лабораторные методы обнаружения инфекций

Существуют разные методы обнаружения инфекций в биологических жидкостях пациентов.

  • Микроскопические методы.

Лаборант при помощи микроскопа выискивает патогенные микроорганизмы в специально окрашенном мазке — пробе выделений из мочеиспускательного канала или со стенки слизистой. Дешево, просто, но малоинформативно. Таким образом, удается разглядеть трихомонад, гонококков, хламидий, уреаплазму и гарднерелл. И все.

  • Культуральные методы (посевы).

Такой же точно мазок наносят на питательную среду в чашке Петри и смотрят, что вырастет. Все микроорганизмы образуют разные колонии — по цвету, форме, размеру и консистенции. Вот по этим колониям и определяется: кто был в мазке. Тоже, в общем, недорого, но долго, выращивание микроорганизмов может длиться от 3 до 8 недель – за это время состояние пациента может значительно ухудшиться. И еще есть один нюанс: вырастет только то, что было в мазке и в определенном количестве. Если патогенных бактерий было слишком мало, то выявить их не удастся.

  • Анализы крови.

Любые возбудители оставляют после контакта с организмом человека свои иммунные следы в его крови: антигены или антитела. Метод не самый дешевый, зато быстрый. Но и тут следует учитывать, что до определенного момента инфекция уже может быть в организме, а антитела и антигены пока еще не выявляются: слишком мало времени прошло или слишком низкая концентрация патогенных микроорганизмов. Кроме того, данный метод не позволяет различать виды отдельных микроорганизмов, которые далеко не всегда опасны для человека.

Итак, у всех методов есть свои недостатки. Среди ключевых можно выделить следующие:

  • Низкая чувствительность, то есть необходимо определенное минимальное количество микроорганизмов в пробе, чтобы их можно было обнаружить.
  • Низкая специфичность, то есть, если у двух разных видов бактерий (один опасный, другой нет) на поверхности клетки есть одинаковые белки, то не все анализы позволяют узнать, какой именно из этих видов имеется в организме.

Обе этих проблемы позволяет решить метод ПЦР.

Этапы диагностики методом ПЦР

Этапы диагностики методом ПЦР

В основе метода лежит факт, что каждый живой организм (микро- или макро-) имеет уникальную ДНК (или РНК – если речь идет о некоторых вирусах). Это лучший маркер присутствия чужеродного микроорганизма в теле человека, какой только можно себе представить. Даже если в пробе присутствуют следовые количества ДНК, значит организм тем или иным способом уже сталкивался с данной инфекцией. А как эти следовые количества «увидеть»? Их нужно для начала «приумножить».

Метод ПЦР состоит из следующих этапов.

  • 1 этап. Подготовка пробы, то есть выделение ДНК.

Предположим, что мы ищем в пробе определенную бактерию, например, хламидию (Chlamydia trachomatis – возбудитель хламидиоза). На этом этапе мы не знаем, есть ли в пробе ее ДНК. Проба специальным образом обрабатывается, чтобы сконцентрировать ДНК, если она там есть, в минимальном объеме жидкости для ПЦР.

  • 2 этап. Амплификация (умножение) ДНК с помощью ПЦР.

Сначала двухцепочечную ДНК «расплетают» путем повышения температуры и получают одноцепочечные нити. После этого в раствор добавляют специальные короткие фрагменты нуклеиновой кислоты — праймеры. Они будут затравкой для синтеза второй цепочки ДНК на одноцепочечной «базе». Итак, база есть, затравка есть, осталось добавить нуклеотиды, из которых будет достраиваться вторая цепочка, и устройство, которое будет заниматься этим строительством. В роли такого устройства выступает фермент ДНК-полимераза, а процесс достраивания одноцепочечной ДНК до двухцепочечной и является полимеразной цепной реакцией.

В начале цикла у нас было две одноцепочечных ДНК, в конце мы получим две двухцепочечных ДНК. И такой цикл повторяется многократно, пока количество ДНК не окажется достаточным для лабораторного анализа. Для умножения ДНК используют специальные аппараты - амплификаторы. На этом этапе исследователи тоже все еще не знают, что за ДНК они амплифицировали и есть ли в пробе ДНК хламидии.

Следует также добавить, что существует множество разновидностей метода ПЦР, которые применяются в зависимости от поставленной перед исследователем задачи.

  • 3 этап. Детекция (определение) ДНК.

На данном этапе как раз и происходит выяснение, есть ли ДНК искомой бактерии в пробе. Раньше для этого использовался метод электрофореза, а позднее ученые стали использовать ДНК-зонды – специальные меченые фрагменты ДНК, которые взаимодействуют только со специфическим участком анализируемой ДНК и позволяют таким образом определять конкретные последовательности нуклеотидов. Наконец, для экспресс-диагностики сейчас используют флуоресцентные маркеры, которые позволяют определять результат ПЦР прямо в реакционной пробирке. Если ДНК х